尊龙凯时为生物医药领域提供PCR产物纯化与回收的标准操作指南，确保研究人员能够高效、准确地进行分子克隆实验。

TOPO克隆PCR产物纯化与回收

1. PCR反应完成后，应对产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，以确认是否出现目标大小的条带。

2. 推荐采用切胶回收法进行纯化，切胶时间控制在3分钟内，以避免紫外线对DNA造成损伤。使用NanoDrop或OneDrop等设备检测回收的浓度，应达到≥30ng/μl，同时再次进行电泳确认仅存在目标条带。

目的片段连接载体

1. 按照说明书要求投入各组分，连接反应体系中各组分的投入体积应≥1μl。如浓度过高，可以适度稀释使用。

2. 连接反应可在25°C或37°C条件下进行，时间设置为5分钟。如克隆效果不佳，可延长至30分钟。

感受态细胞转化与涂板

1. 建议选择DH5α、Fast-T1等化学感受态细胞进行转化。

2. 感受态细胞不应反复冻融使用，建议在-80°C保存后一次性使用。

3. 重组产物与感受态细胞的体积比为1:10，推荐用10μl重组产物与100μl感受态细胞混合，或用5μl重组产物与50μl感受态细胞相结合。

4. 热激时间应根据感受态细胞的说明书进行操作。

5. 确保涂板所用抗生素与转化载体的抗性一致。

6. 对菌液进行离心（2500×g，3分钟），用移液枪去除多余LB培养基，保留100μl重悬液并进行涂板，或根据需求吸取适量涂板。

单克隆菌落PCR鉴定

1. 挑选合适大小的单克隆菌落进行鉴定，避免选择过大或过小的菌落。

2. 挑取多个单克隆菌落进行分析。

3. 将挑取的菌落放入加入10μl ddH2O的EP管中，充分溶解混匀后吸取1-2μl用于PCR反应（10/20μl体系）。

4. 推荐使用一对分别位于片段和载体上下游的引物进行PCR鉴定。

如需构建具备Amp/kana抗性的质粒，请对目标片段进行切胶回收。

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